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1 siDirect设计网站sidirect2rnaijp输入NCBI序列号或序列信息FASTA格式，点击quotdesign siRNAquot网站将提供一系列siRNA设计，包括Tm值脱靶效应等评估信息2 DSIR设计网站输入RNA名字和序列FASTA格式，点击quotRun analysisquot网站根据评分高低排序设计的s。

2LifeTechnologies网站 LifeTechnologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件，操作非常方便，而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast，直接可以用的首先打开网站，在TargetDesignOptions处选中shRNA，以Fli1为例，输入Accessionnumber或Nucleotidesequence，其他条件不变下拉到底点击RNAiDesign，然后出现推荐的10。

在siRNA设计中，软件工具的选择多样，包括， WI siRNA Selection Program， ， ambioncom， Massachusetts Institute of Technology， ， amiRNAi design， WMD3 Web MicroRNA Designer， OligoWalk， RNAxs， iscore Designer， Schramm et al。

siRNA设计网站如DSIRsiDirect和Thermofisher提供了便捷的在线设计工具设计时需在NCBI查找基因编号和序列，注意选择各剪接体共享位置和区别于其他基因保守位置设计完毕后，输入基因编号和序列至设计网站，根据其参数设置进行siRNA设计实验过程中，确保保持siRNA质量，避免RNA酶破坏其结构转染时，选择合适。

shRNA设计通常建议9个核苷酸环，但GC含量3050%的siRNA效果可能更好设计时，需记住5’和3’非编码区的特殊性，以及合成siRNA可能需要多个靶序列来优化效果同时，负对照必不可少，它应与选中的siRNA序列相同但不与mRNA有同源性，可通过打乱顺序来实现现有一些工具如Qiagen公司的网站提供自动siRNA设。

操作流程如诗行般流畅首先，输入Accession Number，锁定目标区域ORF或UTR，确认你的研究对象是Mus musculus接下来，是设计的黄金时刻，你将看到一个个候选siRNA跃然屏幕上，如5#39CCCAGAGTTCTTTGCTCCGCTTATT3#39，每一个序列都蕴含着可能性BLOCKiT设计的siRNA无需额外修饰，但免费工具可能有限制。

siRNA设计原则首先，理想的siRNA应在靶基因的AUG下游50至100个核苷酸内寻找，靠近3#39端的序列通常效果更佳推荐使用AAN nUU或NAN nUUNAN nNN格式，1929个核苷酸最有效，过长可能导致非特异性效果3#39端突出碱基选择dTdT，以增强siRNA双链稳定性GC含量应在35%至55%范围内，以优化。

siRNA表达载体的构建主要包括以下关键步骤和注意事项关键步骤1 目的基因确定明确需要沉默的目标基因2 设计siRNA靶序列从转录AUG起始密码子开始，寻找AA序列，并记录其3’端的19个核苷酸作为候选siRNA靶位点避免针对5’和3’端的非编码区，并排除与其它编码序列或EST同源的序列3 表达载体。

看你自己设计时候的选项如果选的是发夹结构，虽然是单链，但是自己会形成发夹双链结构，如果是很短的20bp，则是单链 siRNA。

最新研究揭示了RNA折叠的规则和机制，这为构建更理想和功能强大的RNA颗粒用于基于RNA的医学提供了可能作者指出，RNA折纸等方法已用于设计RNA支架传递siRNA进行基因敲除抗凝血剂作用体内表达和折叠，以及作为蛋白质支架调节基因表达该研究为改进RNA纳米器件的设计周期提供了结构基础，发表在Nature。

1化学合成 尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的研究人员几乎不需要做什么工作包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的由于价格比其他方法高，为一个基因合成34对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的。

设计目标为靶向人PROK1的shRNA，根据已有方法获得序列5#393#39，包含AgeI酶切位点CCGG，siRNA序列，茎环序列，与siRNA反向互补序列，以及确保末端连续4个U的设计然而，现有质粒缺乏能被识别并留下CCGG粘性末端的酶切位点，而BsaI酶切位点存在多篇文献报道的粘性末端并非CCGG，而是CACC。

基于目标基因序列，精确设计RNA干扰序列，确保高特异性与高效性合成完成后进行严格的质量控制，确保分子纯度与稳定性构建表达载体将设计好的siRNA或shRNA引入载体系统，以便高效递送至目标细胞实施细胞转染或病毒包装将构建好的表达载体递送至细胞内，通过RNAi机制实现基因沉默需要精细的操作与优化。

这解释了为什么在不同文献中，shRNA序列的粘性末端看似不同本文将以设计针对人PROK1基因的shRNA为例，展示如何通过合理设计序列，克服特殊质粒背景下的限制首先，确定了shRNA序列的组成部分，包括CCGG的内切酶AgeI位点特异性siRNA序列茎环序列以及末端设计在粘性末端设计时，需要考虑质粒中存在的。

在功能基因高通量筛选中，阵列筛选验证是获得可靠结果的关键步骤本文通过巧妙设计，采用寡核苷酸池构建CRISPR混合慢病毒文库，实现了siRNA阵列验证，实现了寡核苷酸CRISPR和RNAi技术的结合，以增强筛选效率和准确性筛选流程如下1 寡核苷酸池设计选取332个宿主蛋白基因，每种基因设计10条sgRNA，加上。

LNP的结构研究揭示了siRNALNP的复杂性，这可能对转染效率产生影响脂质的溶解度蛋白质吸附，如ApoE，都在影响LNP的递送效率ApoE不仅参与胆固醇代谢，还影响LNP的内吞过程，而配方中其他脂质的加入也会对ApoE的结合产生影响LNP的个性化设计潜力巨大，但挑战同样存在，如如何优化转染效率脂质在体内的。